+7 (495) 783-84-78

Сравнение альтернативного и стандартного метода определения аэробных микроорганизмов при анализе по показателю «Микробиологическая чистота»

Н.Э Грамматикова1,2*, Ю.М. Копашова1, А.И. Рябова1, И.В. Штейн1 И.А Василенко1

1 – Испытательный центр ООО «ОЛФАРМ»,  127006, Россия, г. Москва, ул. Нагатинская, 3а
2 – Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, 119991, Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2

*E-mail: ngrammatikova@yandex.ru

Резюме. В статье приведены результаты сравнения альтернативного и стандартного метода определения аэробных микроорганизмов в рамках анализа по показателю «микробиологическая чистота». Показано, что при низкой обсемененности препаратов, результаты анализа не зависят от объема агаризованной среды. При количестве колониеобразующих единиц 25 и более необходимо проводить исследование в 15-20 мл агаризованной среды.

Ключевые слова: микробиологическая чистота, КОЕ, объем агаризованной среды.

VERIFICATION OF AN ALTERNATIVE METHOD IN TERMS OF "MICROBIOLOGICAL PURITY"

N.E. Grammatikova1,2, Y.M. Kopasheva1, A.I. Ryabova 1, I.V. Shteyn, I.A. Vasilenko1

1 – LLC “Olpharm”, 3a, Nagatinskaya str., Moscow, Russia
2 – I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 8, Trubetskaya str., Moscow, 119991, Russia

Abstract. The article presents results of the comparison of alternative and standard method for assay of aerobic microorganisms in the analysis in terms of microbiological purity. It is illustrated that the analysis results are independent of the volume of the agar medium at low seeding agents. When the number of colony-forming units is 25 or more, it is necessary to conduct research in 15-20 ml of agar medium.

Keywords: microbiological purity, CFU, volume of agar medium

ВВЕДЕНИЕ

Лекарственные средства, которые не требуют стерильности, независимо от их формы и пути введения должны соответствовать критериям микробиологической чистоты, изложенным в соответствующем издании Государственной фармакопеи.

В разделе «Учет результатов», стр. 175 ГФ РФ XII, часть 1, говорится: «Для количественного определения в ускоренные сроки бактерий и грибов, колонии которых склонны к сливному росту, используют модифицированный глубинный агаровый метод посева». Предложенный в ГФ РФ XII модифицированный метод количественного  определения аэробных бактерий и грибов позволяет учитывать результаты уже через 48-72 часа роста [1,2].

При анализе микробиологической чистоты, кроме достоверности и качества проводимого исследования, сроки проведения испытания – один из важных критериев, определяющий выбор метода.

Целью работы было изучение зависимости роста аэробных бактерий от объема питательной среды в чашках Петри при глубинном и поверхностном посеве.

Сравнение методов на примере лабораторного анализа для микробиологических испытаний нестерильных лекарственных средств по показателю «Микробиологическая чистота».

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тест-микроорганизмы:

Bacillus subtilis ATCC 6633

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

 

Подготовка тест-микроорганизмов

Тест-штаммы, типичные по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, хранились при температуре -75 °С в триптиказо-соевом бульоне с 10% глицерином. Для активации тест-микроорганизмы высевали на агаризованную среду №1 [ГРМ-1 («БиоХолд», Оболенск, Россия)]. Инкубацию проводили в течение ночи (около 18 часов) при температуре (32,5 ±2,5 °С), пересевали на среду № 8 и инкубировали при температуре (32,5 ±2,5°С) в течение 18 часов при тех же условиях.

Тест-культуры разводили в физиологическом растворе до титра 104 КОЕ\мл. Споры B. subtilis разводили физиологическим раствором в соотношении 1:1000 до титра 103 КОЕ\мл.

Конечное количество колониеобразующих единиц  в инокуляте зависило от условий эксперимента.

При анализе лекарственных средств использовали препараты на основе растительного сырья, категории 3б:

«Цистон», таблетки, серия 11302508, производства «Хималайя Драг Ко», Индия.

«Адонис-бром», таблетки покрытые оболочкой, серия 010215, производства ЗАО «ВИФИТЕХ», Россия.

«Сок Алоэ» для приема внутрь, серия 020315, производства ЗАО «ВИФИТЕХ», Россия.

 

Методология

Изучение скорости роста и морфологические особенности осуществляли с  тест-культурой Pseudomonas aeruginosa при поверхностном посеве в чашки Петри содержащей 7, 10, 15 мл агаризованной среды ГРМ-1. Посевную дозу выбирали исходя из опубликованных данных ряда авторов, в работах которых представлены допустимые значения для статистически достоверного количества колоний на стандартной агаризованной среде между 25 и 250 КОЕ на чашку для большинства бактерий и Candida albicans [3,4].

Правильность. В исследовании использовали лекарственные формы, уровень контаминации которых, был определен в предварительном испытании. Для изучения зависимости роста контаминирующих препарат бактерий определяли максимальное и минимальное количество колоний, выросших в агаризованной питательной среде объемом 7-10-15 и 20 мл на чашках Петри при стандартных условиях.

Анализ осуществляли в соответствии с ГФ РФ XII, ч.1, ОФС 42-0067-07.

Подготовленные в соответствии с разделом 2.1. препараты в количестве 1 мл переносили в чашку Петри и заливали питательной средой в объеме, предусмотренном условиями эксперимента. Тщательно перемешивали, оставляли до полного застывания агара, подсушивали до исчезновения конденсата и инкубировали в стандартных условиях.

Посевы просматривали ежедневно.

Точность. Исследование осуществляли сотрудники лаборатории в разные дни с использованием разных партий питательных сред. В качестве тест-культур использовали Bacillus subtilis и Staphylococcus aureus.

Проведенные исследования оценивали по количеству выросших колоний и их морфологическим особенностям в зависимоcти от объема питательной среды в чашке Петри.

Средние значения и стандартные отклонения рассчитывали в программе Microsoft Excel 2010 [5].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Известно, что развитие  микроорганизмов в благоприятных условиях имеет линейную зависимость до тех пор, пока не накапливаются ингибирующие рост метаболиты. В экспоненциальной фазе рост колоний происходит равномерно во всех направлениях.

Естественно, микробиологи, сталкиваясь с представителями микромира, наблюдают и антагонистические свойства, и распластанные колонии или такие особенности, как роение.

Предполагается, что если посевной материал состоит из одного или нескольких микроорганизмов и они получают питательные вещества в достаточном количестве, рост осуществляется  в геометрической прогрессии. С увеличением размера колонии происходит увеличение питательных потребностей. При высокой плотности роста происходит снижение скорости диффузии питательных веществ к колонии, что в конечном итоге приводит к остановке роста.

В экспериментальных работах рядом авторов показано, что увеличение объема арагизованной питательной среды с 5 до 25  мл оказывает заметное влияние на скорость радиального роста колоний. Количество агара для наиболее благоприятного развития микроорганизмов, при котором оптимально расходуются питательные компоненты, составляет 20 мл [6].

Представленные на рисунках 1 и 2 графики наших экспериментальных данных показывают зависимость скорости роста от объема питательной среды в чашках Петри. Оценку скорости роста Pseudomonas aeruginosa проводили по диаметру колоний, выросших в чашках Петри с различным объемом питательной среды.

 

Рисунок 1. Зависимость диаметра колонии микроорганизма от объема среды в чашке Петри, 24 ч (P.aeruginosa)

Рисунок 2. Зависимость диаметра колонии микроорганизма от объема среды в чашке Петри, 72 ч (P.aeruginosa)

 

Динамика роста микроорганизмов характеризуется в основном по двум параметрам: экспоненциальная скорость роста и время задержки, а именно время для адаптации к новым условиям. Общей чертой адаптации микроорганизмов к стрессу является изменение скорости роста. Другие параметры, такие как форма, текстура и цвет колонии используются для  морфологической характеристики.

Снижение объема агаризованной среды до 7-10 мл не позволяет в полной мере оценить макроморфологические особенности микроорганизма, колонии мелкие, типичные признаки отсутствуют.

Рисунок 3. Изменение размера колоний Pseudomonas aeruginosa в зависимости от объема агаризованной среды (ГРМ 1). Типичный рост колоний P. aeruginosa (левая чашка на нижнем фото) и образование пигмента (крайняя правая чашка на верхнем фото) в большей степени проявляются при использовании 15 мл агаризованной среды.

 

Правильность

Количественное определение оценивали в рамках показателя «общее число аэробных бактерий» для препаратов с различной степенью микробиологической чистоты. Определено, что при анализе препаратов «Цистон» (таблица 1) и «Сок Алое» (таблица 2) с низкой обсемененностью, не более 20 КОЕ на чашку, результаты не зависят от объема агаризованной среды.

В препарате «Адонис-бром» определено более 20 колоний на чашку в разведении 1:10. Количество колоний возрастает с увеличением объема агара при условии соблюдения температуры питательной среды не более 45 °С (таблица 3).

Таблица 1

Анализ препарата «Цистон» по показателю «общее количество аэробных бактерий»

№ чашки

КОЕ/мл

Среднее значение КОЕ/чашку

7 мл

1

10

12,66 (13)

2

16

3

12

Станд. отклонение

3,05505

Относ. станд. отклонение (RSD) %

23,6

10мл

1

9

10,33 (10)

2

12

3

10

Станд. отклонение

1,52

Относ. станд. отклонение (RSD) %

14,5

15 мл

1

12

12

2

15

3

9

Станд. отклонение

3

Относ. станд. отклонение (RSD) %

25

20 мл

1

10

12,33 (12)

2

12

3

15

Станд. отклонение

2,51

Относ. станд. отклонение (RSD) %

20

 

Таблица 2

Анализ препарата «Сок Алое» по показателю «общее количество аэробных бактерий»

№ чашки

КОЕ/мл

Среднее значение КОЕ/чашку

7 мл

1

15

18

2

20

3

19

Станд. отклонение

2,64

Относ. станд. отклонение (RSD) %

14,7

10 мл

1

17

20

2

22

3

21

Станд. отклонение

2,64

Относ. станд. отклонение (RSD) %

13,2

15 мл

1

15

20

2

20

3

19

Станд. отклонение

2,64

Относ. станд. отклонение (RSD) %

13,2

20 мл

1

14

17,6 (18)

2

18

3

21

Станд. отклонение

3,51

Относ. станд. отклонение (RSD) %

19,8

 

Таблица 3

Анализ препарата «Адонис-бром» по показателю «общее количество аэробных бактерий»

№ чашки

КОЕ/мл

Среднее значение КОЕ/чашку

7 мл

1

21

24

2

24

3

27

Станд. отклонение

3

Относ. станд. отклонение (RSD) %

12,5

10мл

1

20

24,66 (25)

2

24

3

30

Станд. отклонение

5,03

Относ. станд. отклонение (RSD) %

20,4

15 мл

1

25

34

2

30

3

40

Станд. отклонение

5,29

Относ. станд. отклонение (RSD) %

15,5

20 мл

1

37

40,6 (41)

2

41

3

44

Станд. отклонение

3,51

Относ. станд. отклонение (RSD) %

8,64

 

Содержание микроорганизмов в исследуемом препарате «Адонис-бром» не превышало норму, предусмотренную для соответствующей категории.

После 48 ч инкубации подсчет колониеобразующих единиц произвести не удалось, так как наблюдался сплошной слитой рост независимо от объема питательной среды (рисунок 4).

Рисунок 4. Рост Bacillus. ssp в препарате «Адонис-Бром» в 7, 15 и 20 мл агаризованной среде ГРМ1 после 48 ч инкубации в стандартных условиях

 

Точность

Сравнительный анализ осуществляли глубинным культивированием: микробиолог 1 при посеве B. subtilis АТСС 6633 около 100 КОЕ на чашку, микробиолог 2 при посеве Staphylococcus aureus ATCC 6538 около 200 КОЕ на чашку. Количество колоний считали после 24 часов инкубации в стандартных условиях.

Результаты представлены в таблице 4 и 5.

 

Таблица 4

Микробиолог 1, учет количества колоний B. subtilis АТСС 6633 при посеве глубинным методом в чашки Петри с различным объемом питательной среды ГРМ1.

КОЕ/мл

Среднее значение КОЕ/чашку

7 мл

1

61

71,66 (72)

2

86

3

68

Станд. отклонение

12,89

Относ. станд. отклонение (RSD) %

17,9

10мл

1

76

74,3

2

57

3

90

Станд. отклонение

16,56

Относ. станд. отклонение (RSD) %

22,2

15 мл

1

59

87,0

2

99

3

103

Станд. отклонение

24,33

Относ. станд. отклонение (RSD) %

27,9

20 мл

1

89

86

2

97

3

72

Станд. отклонение

12,76

Относ. станд. отклонение (RSD) %

14,8

 

Сравнение количества колоний B. subtilis АТСС 6633, выросших в 7-10 мл и 15-20 мл агаризованной среды с учетом статистической достоверности показало, что результаты отличаются незначительно, что может быть связано с малой выборкой испытаний. Однако наблюдается тенденция к увеличению числа КОЕ в агаризованной среде с большим объемом

Количество колоний Staphylococcus aureus ATCC 6538 возрастает с увеличением объема агаризованной среды статистически достоверно.

Таблица 5

Микробиолог 2 учет количества колоний Staphylococcus aureus ATCC 6538 при посеве глубинным методом в чашки Петри с различным объемом питательной среды ГРМ1.

 

КОЕ/мл

Среднее значение КОЕ/чашку

7 мл

1

147

152,2 (152)

2

143

3

156

4

160

5

155

Станд. отклонение

6,97

Относ. станд. отклонение (RSD) %

4,58

10мл

1

148

138,2 (138)

2

135

3

136

4

119

5

153

Станд. отклонение

13,21741

Относ. станд. отклонение (RSD) %

9,55

15 мл

1

205

197,6 (198)

2

189

3

201

 

195

 

198

Станд. отклонение

6,06

Относ. станд. отклонение (RSD) %

3,06

20 мл

1

233

232,6 (233)

2

217

3

239

4

244

5

230

Станд. отклонение

10,26

Относ. станд. отклонение (RSD) %

4,41

 

При испытании на микробиологическую чистоту предел микробной загрязненности оценивается с учетом коэффициента 2: если количество  микроорганизмов не более 101, допускает максимальное количество 20 КОЕ, соответственно 102- 200 КОЕ и т.д.

На примере роста S. aureus показано, что при анализе лекарственных форм методом глубинного посева уменьшение объема питательного агара до 10 мл, может привести к ошибочной оценке микробиологической чистоты испытуемого препарата.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты эксперимента показывают, что объем питательной среды оказывает влияние на результаты оценки микробиологической чистоты лекарственных средств как при поверхностном, так и глубинном посеве.

При сравнении стандартного и альтернативного методов для исследования микробиологической чистоты по показателю «количественное содержание аэробных бактерий» при глубинном посеве видно, что, если количество колоний на чашках не превышает 25 КОЕ, результаты анализа не зависят от объема агаризованной среды. При количестве колониеобразующих единиц 25 и более, по нашим данным, желательно проводить исследование в 15-20 мл агаризованной среды.

Обнаруживается четкая динамика увеличения скорости роста колоний с увеличении объема агаризованной среды в чашках.

Полученный эффект, вероятно, связан с конкуренцией за питательный субстрат. Видимые колонии могут формироваться как из одной клетки, так и из десятка тысяч, т.к. распределение микроорганизмов в лекарственных формах на твердых частицах препарата или в суспензии неоднородно. Таким образом, быстро формирующиеся колонии микроорганизмов, потребляя субстрат, тормозят рост более медленно развивающихся, что усугубляется при уменьшении количества питательного субстрата. При небольшом количестве колоний на чашке такого конкурентного торможения роста не наблюдается.

Кроме того, если препарат проявляет слабую антимикробную активность или в процессе производства контаминирующие микроорганизмы подвергались стрессовым факторам, увеличение агаризованной среды до 20 мл позволяет снизить эти влияния.